Чем выше концентрация агарозы тем эффективнее происходит разделение фрагментов меньшего размера
Агарозы: Какие факторы необходимо учитывать при выборе типа агарозы
Какой концентрации готовить агарозный гель?
Наиболее часто используемая концентрация агарозного геля для разделения фрагментов нуклеиновых кислот (НК) колеблется в пределах 0,5-4 %. Концентрация геля выбирается в зависимости от типа агарозы и размера разделяемых фрагментов. Чем больше концентрация агарозы, тем меньше должны быть разделяемые фрагменты.
Есть ли различия в использовании ТАЕ и ТВЕ буферов для приготовления агарозного геля и последующего электрофореза?
Оба буфера могут быть использованы как альтернативные для любого типа агароз.
ТАЕ буфер обладает низкой ионной силой и буферностью, поэтому необходимо обновлять буфер (рециркуляция) при длительном электрофорезе. ТАЕ буфер рекомендован для разделения больших фрагментов (более 10 т.п.н.).
ТВЕ буфер обладает высокой ионной силой и буферностью, поэтому рециркуляция не требуется даже при длительном электрофорезе. ТВЕ буфер рекомендован для разделения небольших фрагментов (менее 1 т.п.н.) и фрагментов с небольшими отличиями в размере между собой.
Какой буфер рекомендован для аналитического электрофореза?
Можно использовать оба буфера, ТВЕ (0,5х или 1х) и ТАЕ (1х).
Какой буфер рекомендован для препаративного электрофореза?
Рекомендован ТАЕ буфер. Ионы борной кислоты в ТВЕ буфере взаимодействуют с гидроксильными группами полисахаридов, что может препятствовать выделению ДНК из геля для дальнейших манипуляций.
Насколько важно применять рециркуляцию буфера в процессе длительного электрофореза?
Рециркуляция препятствует образованию градиента рН и истощению буфера, таким образом, рециркуляция необходима при длительном электрофорезе в ТАЕ буфере из-за его низкой буферности.
Какой вольтаж использовать при проведении электрофореза?
Рекомендуется 4-10 вольт на см геля при горизонтальном электрофорезе. Если вольтаж слишком низкий, то подвижность фрагментов снижается и они расползаются. Если вольтаж слишком высокий, четкость разделения фрагментов снижается за счет перегревания геля.
Иногда фрагменты получаются кривые, волнистые. Чем это может быть вызвано?
Наиболее частая причина появления волнистых фрагментов – это прилипание остатков сухого геля к зубьям гребенки. Для предотвращения этого гребенка должна быть хорошо вычищена перед использованием. Рекомендуется подержать гель при 4 °С 30 минут, а также погружать застывший гель в буфер перед вытаскиванием гребенки.
Какое количество ДНК необходимо загружать на одну лунку?
Минимальное количество ДНК на лунку при детекции бромистым этидием составляет 10 нг. Максимальное количество ДНК на лунку составляет примерно 100 нг. Это количество может меняться, если вы используете другие красители ДНК. Для определения оптимального количества рекомендуется загрузить лунки с разным количеством ДНК (например, 10, 20, 30 нг и т.д.) и выбрать наиболее подходящий вам вариант.
Как следует готовить гель для получения лучшей четкости разделения фрагментов?
Рекомендуемая толщина геля 3-4 мм. Толщина гребенки тоже важна. Тонкая гребенка (1мм) дает хорошо различимые фрагменты, тогда как толстая гребенка дает широкие фрагменты, что снижает четкость.
Какой рекомендуется метод для приготовления агарозного геля?
Наиболее часто используют микроволновки для приготовления агарозного геля. Для высоких концентраций геля, когда высока вероятность образования пены, рекомендуется использовать водяную баню. Приготовления агарозного геля в автоклаве подходит для очень высоких концентраций, а также, когда нужен стерильный гель.
Как предотвратить образование пены во время приготовления агарозного геля?
Перед нагреванием рекомендуется оставить колбу с агарозой и буфером на 10-15 минут. Это уменьшит вероятность образования пены и сделает растворение агарозы более легким.
Чем выше концентрация агарозы тем эффективнее происходит разделение фрагментов меньшего размера
Особенности работы с низкопроцентными (0.3%) гелями.
ВНИМАНИЕ! Работать в холодной комнате. Гель очень хрупкий, все манипуляции проводить только вместе с 2% подложкой; не лить буфер на поверхность геля. Низкопроцентные гели особенно чувствительны к перегрузке по количеству DNA на дорожку.
Разделение линейных молекул
Диапазон нормального разделения линейных dsDNA молекул для гелей с различной концентрацией агарозы:
|
Меньший предел определяется (в основном) диффузией полосы в геле. Т.е. в гелях с низкой концентрацией агарозы мелкие фрагменты вполне разделяются, но полосы не четкие.
Верхний предел сильно зависит от напряженности поля, при которой проводится форез. Чем меньше напряженность поля, тем более длинные молекулы можно эффективно разделить.
Разделение суперскрученных и кольцевых молекул
К сожалению относительная подвижность линейных и кольцевых молекул зависит от условий фореза: % геля, скорость фореза (в частности, это означает, что нельзя пользоваться линейным маркером для оценки размера кольцевых молекул).
Приведенная таблица дает некоторое представление о соотношении подвижностей при умеренной (
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
В присутствии 0.5 µg/ml EtBr разрешение релаксированной и суперскрученной pDNA увеличивается примерно в 20 раз при повышении ионной силы буфера до 4хТАЕ. Того же увеличения можно добиться понижая концентрацию EtBr.
На 1% агарозном форезе ssDNA бежит чуть быстрее (
10%), чем dsDNA того же размера. ssDNA окрашивается EtBr заметно слабее, чем ds (разница в
4-5 раз). Tо есть, чтобы полосы имели одинаковую интенсивность окраски, требуется взять
в 5 раз больше ssDNA.
Чтобы разделить цепи, нужно либо непосредственно перед форезом прогреть
1′ 100 o C, либо добавить к образцу NaOH до 0.1 М, 5-10′ (NT или 37 o C);
При оценке напряженности поля для горизонтального фореза принято пренебрегать конкретной геометрией камеры и измерять расстояние непосредственно между электродами.
На рисунке показана схема форезов, при разном напряжении. Форезы проводились разное время, так, чтобы 0.5kb фрагмент прошел одинаковое расстояние. Видно, что проведение фореза при высоком напряжении эквивалентно уменьшению длины геля.
Разумный компромисс между скоростью и качеством фореза для высококачественных или препаративных форезов:
2V/cm(можно меньше для ON форезов). Для аналитических форезов приемлемое качество сохраняется до
DNA особенно легко теряет EtBr при повышенной температуре (что обычно случается, если гонять форезы при высоком напряжении).
EtBr при форезе движется от (+) к (-). Если хочется, чтобы он не уходил из геля, лучше ввести его и в форезный буфер.
Количество DNA, которое можно наносить на дорожку
Нижний предел определяется используемым методом детекции. Если применяется окрашивание EtBr, то не стоит надеяться увидеть 2 O; рабочая концентрация в 1х буфере
0.01-0.05%) наиболее подвижный краситель, практически всегда находится вне «рабочей зоны». Заметен под UV.
Краситель в буфере нужен лишь для того, чтобы образец был легко заметен в лунке и в геле. Обычно приводимые в методиках
0.025% для бромфенолового синего и ксиленцианола (в 1х буфере) по нашему мнению слишком большое количество.
Лучше иметь на столе
* буфера с различными красителями.
* различные разведения буфера для внесения (10х, 2х, 1х). При этом образец любого объема собирается из двух компонентов (буфер+образец), а не из трех (буфер+ вода + образец).
1x если объем образца 25-75%;
10x ==> 75%
Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/
 | ||||||||||||||||||||
Дополнения, комментарии, вопросы Для оптимального разделения не очень больших фрагментов, можно пользоваться буфером для внесения по рецепту, указанному в каталоге MBI Fermentas: 6x Orange Loading Dye Solution (#R0631) Люди, хелп! Если кто-нибудь знает что-то про технологию внесения биополимеров в гель под названием Shark Teeth, напишите, пожалуйста! А почему бы заодно не добавить в текст, что рабочая концентрация бромистого этидия, например, 0,5 мкг/мл и что его можно добавлять прямо в гель, что гель с добавленным в него EthBr спокойно стоит ночь под электродным буфером без заметного вымывания из него краски? Полезные, вобшем-то факты, хоть и мелкие, но, с моей точки зрения, вполне не лишние. 2Re: что это гребенка такая, я знаю. Только сейчас вижу, что по формулировке моего вопроса кажется, будто это гель так называется:) Все, спасибо, уже поздно:) Только по моим данным, это имено про форез. Не знаю уж, про агарозный или ПААГ, по-моему, в данном случае не суть важно Лучше читать последнюю. народ, а как точно называется маркер мол веса (лестница)? и куда, как ее наносить? 1: Biotechniques. 2004 Feb;36(2):214-6. Links Erratum in: Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA. All: 1 1: Electrophoresis. 2001 Mar;22(5):814-28.Click here to read Links Clare Chemical Research, Inc, Denver, CO 80206, USA. mseville@clarechemical.com The Dark Reader optical system (Clare Chemical Research, Denver, CO, USA) uses relatively low intensity broad-band visible blue light in combination with broad-band optical filters to detect fluorescence with a level of sensitivity that often surpasses that of UV transilluminators and can rival that of laser-based scanners. Applications of DR (Clare Chemical Research) devices include the detection of DNA and SYBR-stained protein samples following, and also during, electrophoresis. Unlike laser-based imaging systems, the fluorescence is directly visible to the user as well as being fully compatible with charge-coupled device (CCD) and Polaroid camera-based detection and imaging. Additionally, the DR optical system functions well in multicolor fluorophor environments. Because the Dark Reader does not emit any UV light, the extent of DNA damage incurred when visualizing DNA samples is drastically reduced compared to the damage produced by a UV device and this can have a significant benefit on downstream cloning protocols. Furthermore, dye photobleaching is minimal, extending the length of time that a fluorescent sample is visible. The inherent flexibility of the DR optical system allows many different configurations of the Dark Reader to be constructed such as transilluminators, hand lamps and integrated transilluminator-electrophoresis units. Today’s Featured Review Until recently Sybr green had been our labs nucleic stain of choice. We have, however, recently migrated to Biotium’s GelRed. GelRed is a newer nucleic acid gel stain that is safer and more temperature stable than other dyes. GelRed is safer because it is non mutagenic and is diluted in water. It is more thermostable than Sybr dyes because it does not degrade with repeated freeze-thaws or long storage (couple months at RT) and can be stored at room temperature, and sensitivity seems to at least equal if not exceed Sybr green when visualized with UV transilluminator. The dye is used similarly to Sybr dyes with staining (available at 10,000X ) or direct sample additions. The technology is not particularly ground breaking or new but the safety profile of this product makes it a viable alternative to potentially more dangerous dyes. Review by Vitelli Using GelGreen ‘In-Gel’ Save even more Time. FlashGel™ DNA System The FlashGel System is the fastest way to separate DNA and the only way to watch DNA migration as it happens. This revolutionary new tool separates DNA in 2 – 7 minutes. Monitor gel runs right at the bench, without UV light. The highly sensitive system allows a 5X reduction in DNA levels – saving both time and money. * Get results in 5 minutes or less. The FlashGel System consists of enclosed, disposable, precast agarose gel cassettes and a combination electrophoresis and transilluminator unit. * FlashGel Cassettes contain precast, prestained agarose gels and buffer – no need for gel preparation, buffer addition or gel staining. всем привет. а при какой процентности геля? Я так понимаю, как мигрируют красители именно от этого и зависит Как лучше выделить днк 200п.н. из геля для последующей амплификации. Скорее всего малая концентрация? Спасибо —Заранее спасибо ответившим, особенно ответившим правильно —а при какой процентности геля? Я так понимаю, как мигрируют красители именно от этого и зависит. Вроде красители в агарозе мигрируют на одно и тоже Rf не зависимо от процентности. А вот фрагменты сильно зависимо от процентности. Берете 2 маркера 100b и 1000b и в разных процентностях агарозы гоните с красителями и очень хорошо определяете, что с чем бежит. 3 процентный агароз вам уже трудно будет растворить. Я так дУмаю-у Мне кажется это лишняя работа элюировать ДНК из геля для последующей амплификации. Срез геля в воду, заморозить-разморозить и 1-2 мкл на ПЦР. Вы реамплифицируете кг. Спасибо, попробую на следующей неделе. А что если уже выделил из геля с помощью QG и при исходнике с приблизительной количеством 50 нг получил 40 мкг в 40 мкл. На форезе 1,2% в 10 мкл пробы ясен перец ничего не видно, агароза супер. Поставил на ПЦР, отправил 20 мкл в смесь, жду результатов. Сколько приблизительно может быть продукта? Спасибо Вопрос 1: Может ли в реакции сильнее амплифицироваться плазмида, чем нужная вставка?? Если требуется проконтролировать циклизацию 3kbp фрагмента, то надо использовать 2% агарозу. если у Вас не нарабатывается большое кол-во продукта (20 нг в мкл и выше), дело уж конечно не в пирофосфатах- откуда бы им взяться, коли буквы не включились в амплификат (его мало)? Скорее всего проблемы с праймерами- посмотрите, нет ли «бомбы» (димер праймеров) внизу, или полимераза дохнет, что вря ли. Если проблема не лечится «в лоб», то просто замешайте исходно большой объем смеси, грубо говоря, накопите продукт экстенсивным путем, и всех делов. Здравствуйте, подскажите чем красить агарозный гель после щелочного электрофореза? И на какой стадии (до или после фиксирования в кислоте). Обязательно ли сушить? -Здравствуйте, подскажите чем красить агарозный гель после щелочного электрофореза? Бромий этидием или сибирским зеленым и иже с ними -до или после фиксирования в кислоте. «если я скажу всем известную вещь: вносить образцы в лунки гораздо проще, если под камеру подложить листок темной (черной или синей) бумаги, чтобы оттеняла лунки» Можно ли заменить ТВЕ-буфер на Трис-СІ+EDTA для фореза ДНК, и какой молярности?
|
 ГОТОВЫЕ_ГЕЛИ_05.pdf 
Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот и их фрагментов в полиакриламидных и агарозных гелях отличается от разделения белков рядом особенностей, обусловленных структурой этих биополимеров. В нейтральной и щелочной средах молекулы нуклеиновых кислот заряжены отрицательно, поскольку их заряд определяется диссоциацией фосфатных групп. Величина этого заряда мало зависит от рН окружающей среды, а отношение заряда к массе практически одинаково для всех нуклеиновых кислот. Таким образом, фракционирование идет за счет размеров и формы молекул. Для электрофоретического разделения полинуклеотидов используют эффект молекулярного сита, присущий полиакриламидным и агарозным гелям. Для фракционирования фрагментов ДНК размером меньше 100 пар нуклеотидов обычно используют полиакриламидные гели с разными концентрациями полиакриламида (3,5% – 20%). Более крупные молекулы ДНК разделяют в агарозном геле.
Закрыть электрофоретическую камеру и включить напряжение. ДНК движется в электрическом поле от катода (-) к аноду (+). Напряженность электрического поля должна составить 2 В/см в течение первых 15 мин для вхождения проб в гель (30 – 40 В) и затем 3 – 5 В/см (60 – 70 В) в течение примерно 1 – 1,5 ч.