Фракция фетальной днк что это такое

Фетоплацентарная ДНК — новый пазл в пренатальной диагностике

При каждой беременности существует риск хромосомных нарушений. Наиболее диагностически значимым является выявление анеуплоидий, то есть наличия аномального числа хромосом в клетке (в отличие от эуплоидной клетки с 46 хромосомами).

Установленные программы скрининга определяют риск возникновения синдрома Дауна (относительно высокая частота — 1/800 живорождений), также рассматривают синдром Эдвардса (трисомия 18), синдром Патау (трисомия 13) и синдром Шерешевского-Тернера (чаще полное отсутствие одной из Х хромосом — моносомия 45, X0, либо аномалии второй Х-хромосомы) [1].

Пренатальная диагностика и скрининг проводятся как инвазивными, так и неинвазивными методами. Инвазивные подходы, такие как взятие проб ворсин хориона (CVS) и амниоцентез, включают хирургическое введение зондов в матку и являются высокоточными. Хромосомный анализ культивируемых ворсин хориона и клеток амниотической жидкости может выявить не только анеуплоидию плода (рис. 1), но и структурные перестройки, такие как транслокации и инверсии, а также относительно большие дупликации и делеции, обычно размером более 5 мБ (мБ — мегабаза, единица длины фрагмента ДНК, равная 1 млн нуклеотидов) [2]. Хромосомный анализ клеток околоплодных вод считается «золотым стандартом» в пренатальном скрининге ввиду крайне низкого процента ошибок (менее 0,01–0,02 %). Кроме методов обычной цитогенетики, используются молекулярно-генетические исследования: флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция в реальном времени (QF-ПЦР) и мультиплексная, зависимая от лигирования амплификация зонда (MLPA). Данные методы позволяют получить более быстрый результат, но имеют ограничения по спектру выявляемой патологии, для них рекомендовано дальнейшее подтверждение кариотипированием. Однако все инвазивные методы вызывают физический дискомфорт и потенциально вредны для плода, а также ассоциируются с 1–2 % риском потери беременности [1].

Рисунок 1 | Кариотипирование — синдром Дауна: 47, XY, + 21, трисомия 21 [2].

Напротив, неинвазивные тесты на основе изменения уровня внеклеточной эмбриональной ДНК (cell-free DNA, cfDNA) являются безопасными и обеспечивают раннее обнаружение распространенных анеуплоидий со значительно более высокой чувствительностью и специфичностью, по сравнению с ультразвуковым исследованием. В 1997 году Lo с коллегами обнаружили ДНК фетальных трофобластов в крови матери. Часто используется термин «эмбриональная ДНК», хотя происходит она из структур плаценты, поэтому более точным является понятие фетоплацентарной ДНК (рис. 2) [3]. Постоянное обновление ворсинчатого трофобласта приводит к вытеснению апоптотического материала в материнскую циркуляцию. При этом бесклеточная фетоплацентарная ДНК составляет всего 3 % от общей бесклеточной циркулирующей ДНК на ранних сроках беременности, увеличиваясь до 6 % на поздних сроках беременности. Отличить собственно материнскую и фетоплацентарную внеклеточную ДНК позволяет значительно меньшие размеры последней — около 200 пар нуклеотидов [4].

Рисунок 2 | Неинвазивная пренатальная диагностика с использованием анализа внеклеточной фетоплацентарной ДНК.
Real-time ПЦР — количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени — используется для одновременной амплификации (увеличения числа копий) и измерения количества данной молекулы ДНК. Измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. MPS — массивное параллельное секвенирование или секвенирование следующего поколения (next-generation sequencing, NGS). Секвенирование — анализ последовательности нуклеотидов в составе макромолекул, являющихся единицами наследственной информации.

Соответственно, неинвазивный пренатальный скрининг (NIPS) становится все более распространенным в качестве надежной процедуры выявления анеуплоидий. Американский колледж медицинской генетики и геномики (ACMG) предложил NIPS всем беременным женщинам, независимо от их статуса риска для скрининга анеуплоидий с участием хромосом 21, 18 и 13 [5].

На сегодняшний день подавляющее большинство методов NIPS используют массивное параллельное секвенирование (MPS) или секвенирование нового поколения (next-generation sequencing, NGS), позволяющее одновременно определять нуклеотидные последовательности множества различных нитей ДНК, для измерения количества хромосомных копий с использованием cfDNA, полученной из материнской плазмы, в которой ДНК фетоплацентарного происхождения составляет от 2 % до 40 % от общей свободной ДНК. Фактическая фракция ДНК плода зависит от таких факторов, как гестационный возраст (концентрация возрастает с увеличением срока гестации, раннее обнаружение возможно уже с 5 недели и практически всегда — с 7 недели), вес матери (обратная зависимость: чем выше вес, тем меньше концентрация) и метод экстракции. Для анализа секвенирования используется такой показатель как фракция плода (ff). Ff — это количество внеклеточной эмбриональной ДНК в данном образце по отношению к общему количеству внеклеточной ДНК. В любом гестационном возрасте ff имеет нормальное (Гауссово, симметричное, колоколообразное) распределение, которое достигает максимума между 10 и 20 % на 10–21 неделе [6].

Повышение уровня фетальной внеклеточной ДНК в материнской крови отражает активацию апоптотических, некротических и воспалительных процессов в плаценте, что делает этот маркер перспективным для оценки риска развития таких осложнений беременности, как преэклампсия, преждевременные роды, задержка роста плода [7].

Внеклеточная фетоплацентарная ДНК является новым биомаркером, который может стать важным фрагментом в воспроизведении полной картины плоидности эмбриона, состояния плаценты, прогнозирования различных клинических проблем. Трудности в интерпретации все еще сохраняются, требуется более полное изучение факторов, влияющих на выработку, метаболизм и клиренс фетоплацентарной ДНК. Важным ограничением использования cfDNA является то, что пациентки с низкой фракцией плода для своего срока гестации, приводящей к «нерегистрируемому результату», зачастую имеют повышенный риск анеуплоидии плода. В этом случае требуется применение инвазивных методов цитогенетики.

Источник

Фракция фетальной днк что это такое

Неинвазивное пренатальное тестирование (НИПТ), также известное как анализ внеклеточной ДНК и неинвазивный пренатальный скрининг (НИПС), является важным дополнением к ряду скрининговых тестов на хромосомные аномалии плода.

Уже есть достаточно доказательств того, что НИПТ превосходит другие методы скрининга. Тем не менее, НИПТ имеет ограничения и особенности, которые должны понимать назначающие тест врачи и их пациенты.

Эта статья составлена на основании клинических данных и рекомендаций профессиональных сообществ (ACOG, EBCOG, РОАГ). В ней кратко описывается техническая основа анализов НИПТ и сравниваются характеристики производительности НИПТ с существующими скрининг-тестами. Также здесь обсуждается клиническое использование НИПТ.

Несмотря на то, что чувствительность и специфичность теста, как ожидается, останутся неизменными среди широкой популяции, PPV теста варьируется в зависимости от распространенности состояния в данной популяции. Чем реже состояние в данной популяции, тем ниже PPV, в то время как чувствительность и специфичность остаются неизменными.

В этом же примере у 1% женщин, получивших отрицательный результат, ожидается беременность с патологией (ложный отрицательный результат).

НИПТ является общепризнанным методом антенатального скрининга трисомии 21, 18, 13 и некоторых других хромосомных аномалий. При правильном использовании он повышает частоту выявления хромосомных аномалий у плода, снижая количество необходимых инвазивных процедур. И все же до сих пор многие врачи недостаточно осведомлены об особенностях этой технологии, ее преимуществах и недостатках. Понимание научной основы НИПТ, а также показаний для клинического использования теста и ограничений позволит врачам проводить оптимальный скрининг.

Пренатальный скрининг на хромосомные аномалии проводится для выявления женщин с повышенным риском патологии плода. Скрининг также помогает им принимать обоснованные решения о том, следует ли перейти к диагностическому инвазивному тестированию. [1]

Клинически значимые хромосомные аномалии плода обычно связаны с избытком или нехваткой генетического материала. Они могут отличаться по размеру от небольших сегментов хромосом (микродупликации или микроделеции) до целых хромосом (анеуплоидии). [2]

Наиболее распространенной хромосомной аномалией является трисомия 21 (дополнительная копия хромосомы 21), которая вызывает развитие синдрома Дауна. Другие анеуплоидии плода обычно связаны со спонтанным прерыванием беременности, но некоторые, особенно трисомия 18 и 13, могут закончиться рождением ребенка. Большинство случаев трисомии 21, 18 и 13 возникает de novo (как спонтанное событие), хотя в редких случаях может иметь место хромосомная перестройка у родителей, такая как транслокация. Вероятность каждой из этих трех анеуплоидий увеличивается с возрастом матери. [3]

Диагностическое тестирование требует инвазивной процедуры. Оно проводится между 11 и 14 неделями беременности путем взятия пробы ворсин хориона (CVS). Кроме того, после 15 недель беременности с помощью амниоцентеза проводят забор околоплодных вод. [5] Обе процедуры сопряжены с некоторым риском внезапного прерывания беременности. Степень риска обычно указывается как 0,5–1%, хотя последние метаанализы предполагают, что на самом деле риск, связанный с инвазивной процедурой, может быть намного ниже. [6]

После проведения инвазивной диагностики проводится генетический анализ клеток плода. Самым информативным методом анализа количества и структуры хромосом является микроматричный хромосомный анализ. [2]

Внеклеточная ДНК (cfDNA) состоит из коротких фрагментов ДНК, которые выделяются в плазму в результате нормального клеточного обмена и быстро выводятся из кровообращения. У беременной женщины большая часть cfDNA выделяется из собственных клеток. Тем не менее, некоторая часть, содержащая генотип плода, также выделяется из наружного слоя клеток трофобласта плаценты. [7] Доля cfDNA, полученная из трофобласта, называется фетальной фракцией или фракцией плода. Существует широкий диапазон норм фракций плода. Среднее значение на 10 неделе беременности составляет около 10%. [8]

Как правило, в анализах НИПТ исследуется доля cfDNA, полученная из специфических хромосом. Анеуплоидия плода может привести к отклонению этих пропорций от ожидаемых значений, и для определения значимости таких отклонений применяются статистические тесты. [9], [10] Поскольку большая часть cfDNA является материнской, для выявления аномалии конкретной фетальной хромосомы требуется достаточная доля фракции плода. Поэтому многие анализы НИПТ учитывают минимально допустимый уровень фракции плода, и образцы с долей плода ниже определенного порога не дают результата. [8], [11], [12]

НИПТ может проводиться в любой момент беременности, начиная с 10 недель, чтобы повысить вероятность достаточной фракции ДНК плода. НИПТ обычно требует особой формы запроса и может быть рекомендован доктором (врачом общей практики или акушером), который участвует в дородовом наблюдении пациентки.

НИПТ по сравнению с комбинированным скринингом первого триместра

С помощью скрининга первого триместра можно добиться уровня обнаружения 80% для трисомии 21, 18 и 13 с частотой ложноотрицательных результатов 20%. [4], [13] В объединенном мета-анализе частота обнаружения по различным методам НИПТ составила чуть более 99% для трисомии 21, 96% для трисомии 18 и 91% для трисомии 13. Совокупный уровень ложноотрицательных результатов был 0,012%. [14]

Помимо снижения ложноотрицательных показателей важными клиническими параметрами являются положительные и отрицательные прогностические значения (PPV и NPV) скринингового теста. Эти значения частично зависят от календарных характеристик теста, но также меняются в зависимости от распространенности тестируемого состояния в популяции. [15] Низкая распространенность патологии приведет к снижению PPV и увеличению NPV скринингового теста, тогда как высокая распространенность будет иметь противоположный эффект.

Прогнозируемые PPV и NPV могут быть смоделированы для трисомии 21, предполагая, что уровни обнаружения составляют 99% и 90% и ложноотрицательные значения 0,012% и 20% для НИПТ и скрининга первого триместра соответственно. Таблица 1 показывает PPV результата скрининга высокого риска и NPV результата скрининга низкого риска для трех групп с разными уровнями исходного риска.

Результат НИПТ может оказаться недостоверным по техническим причинам. Например, поскольку НИПТ основан на подсчете статистики, всегда будет небольшое количество статистических выбросов. Существует также несколько потенциальных биологических причин ложноотрицательных или ложноположительных результатов НИПТ, [9], [10] включая следующие:

Сложности НИПТ

НИПТ является эффективным методом скрининга на предмет таргетных хромосомных аномалий, но важно знать о связанных с этим сложностях, которые следует учесть на предварительном консультировании

Низкая фракция плода и неудачные анализы

Часть образцов НИПТ не может дать интерпретируемый результат. Это может происходить по разным причинам, включая низкую фракцию плода, проблемы, связанные с тестируемым образцом, или недостаточное качество данных. [10], [12], [14] Частота неудачных анализов НИПТ варьируется от 1,6% до 6,4%. [17], [20]

Фракция плода увеличивается со сроком беременности и обратно коррелирует с весом матери. [8], [11], [20] Есть свидетельства того, что фракция плода может меняться из-за других материнских или плацентарных факторов. [21] Фракция плода становится ниже при наличии определенных хромосомных аномалий плода, особенно трисомии 13 и 18. Следовательно, если НИПТ не дал результата по причине низкой фракции плода, это может говорить о повышенном риске указанных аномалий, даже если иными путями этот риск выявить не удалось. [12], [17], [20]

Поэтому Американский колледж медицинской генетики и геномики рекомендует в случае отсутствия возможности расчета риска проводить инвазивное тестирование. [18] В качестве альтернативы можно интерпретировать неудачный НИПТ в контексте других индикаторов риска по итогам скрининга и УЗИ. [12] Если другие факторы указывают на высокий риск хромосомной аномалии, лучше всего дополнительно пройти инвазивный тест. Для пациентов с низким риском, особенно если они находятся на ранней стадии беременности, можно рассмотреть повторение НИПТ. Повторное тестирование дает результат приблизительно у двух третей пациентов. [12], [20]

Какие хромосомные нарушения следует проверить?

В дополнение к трисомии 21, 18 и 13 многие поставщики НИПТ предлагают дополнительный скрининг на анеуплоидию половых хромосом. В целом, клинические проявления анеуплоидии половых хромосом менее тяжелы и более вариабельны, чем аутосомные анеуплоидии. Уровень обнаружения НИПТ составляет приблизительно 90%, а уровень ложноположительных результатов составляет примерно 0,4%. [14] PPV обычно ниже, чем при аутосомной анеуплоидии, главным образом из-за ограниченного плацентарного мозаицизма или аномалий материнской половой хромосомы.

Какие хромосомные нарушения не обнаружит НИПТ?

Трисомия 21, 18, 13 и анеуплоидия половых хромосом составляют большинство хромосомных аномалий, которые выявляют с помощью кариотипирования по итогам инвазивного теста. Тем не менее, существует ряд других хромосомных аномалий, которые по отдельности встречаются редко, но в целом относительно распространены. Эти более редкие генетические патологии могут вызывать структурные аномалии плода или изменять параметры скрининга, такие как толщина воротникового пространства или показатели материнской сыворотки. [5]

При выявлении врожденных пороков развития и маркеров хромосомных аномалий увеличивается риск наличия у плода более редких генетических патологий. НИПТ может не выявить 20-30% потенциально важных хромосомных нарушений у пациентов с высокой оценкой риска по обычным скрининговым тестам. Остаточный риск атипичных отклонений после результата НИПТ с низким уровнем риска в этой группе может составлять 1-2%. [22]

Если учитывать также микроделеции и микродупликации, которые выявляет пренатальный ДНК-микрочип, доля потенциально значимых отклонений, обнаруживаемых с помощью НИПТ, дополнительно снижается. [24]

Клиническое применение НИПТ

Основное клиническое преимущество НИПТ заключается в увеличении частоты выявления таргетных отклонений при одновременном уменьшении количества ложноположительных результатов и инвазивных тестов. Однако, учитывая его сложность и стоимость, оптимальное использование НИПТ остается предметом дискуссий.

Предпочтительно проведение УЗИ для установления:

Если первым проводится биохимический скрининг:

Высокий риск

Рекомендован диагностический инвазивный тест, если были выявлены ВПР или маркеры хромосомной патологии.

Средний риск

Низкий риск

Если первым проводится НИПТ:

Высокий риск

Низкий риск

НИПТ — это скрининг-тест, который проводят на свободно циркулирующей ДНК (cfDNA), полученной из трофобласта, после 10 недель беременности. Его основная полезность заключается в увеличении частоты выявления таргетных анеуплоидий при одновременном снижении частоты инвазивного тестирования.

Поскольку НИПТ является скрининг-тестом, всегда следует учитывать возможность ложноположительных или ложноотрицательных результатов для таргетных патологий. Результаты НИПТ следует интерпретировать с учетом всей имеющейся информации о беременности. Если скрининг-тест показал высокий риск наличия какой-либо аномалии, следует уточнить результат с помощью инвазивного тестирования до принятия необратимых решений о судьбе плода.

В случае с НИПТ есть сложности, связанные с соответствующими целевыми отклонениями, остаточным риском атипичных хромосомных отклонений и нерезультативными тестами. Кроме того, не существует единого оптимального протокола для клинического использования. Несмотря на это, он предлагает явные преимущества с точки зрения PPV и NPV для целевых хромосом и должен рассматриваться как вариант для беременных пациенток. [1]

Источник

Что такое НИПТ и почему об этом исследовании столько говорят в последнее время? Какие преимущества у данных тестов? Кому они показаны и существуют ли ограничения? Сегодня мы найдём ответы на эти и другие актуальные вопросы.

Биохимические скрининговые программы не обладают высокой точностью, они основаны на cовокупности данных статистики, уровня гормонов и размеров плода по УЗИ. Амниоцентез – самый точный метод, но он инвазивный (нужно сделать прокол плодного пузыря, чтобы получить для исследования клетки, принадлежащие плоду) и угрожает развитием осложнений и прерыванием беременности.

Медицинская наука не прекращала поиски новых тестов для скрининга, которые были бы более точны и не зависели от расчётных показателей. В качестве скрининговых тестов в последнее время хорошо себя зарекомендовали НИПТ (неинвазивные пренатальные тесты) как надёжные, удобные и не мешающие нормальному протеканию беременности. Точность метода достигает 99,9%, так как исследуется генетический материал плода (его ДНК) в венозной крови будущей матери.

Как это возможно? Учёные выяснили, что начиная примерно с 10 недели беременности в крови женщины свободно циркулирует ДНК плода. Благодаря современным технологиям врачи научились выделять её и исследовать, выявляя самые распространенные изменения хромосом.

Таким образом, почти каждая женщина может сдать венозную кровь, дождавшись срока 10 недель беременности, и определить генетическое здоровье будущего малыша.

В каких случаях исследование с применением НИПТ будет наиболее полезно?

В спектре лаборатории KDL представлено несколько комплексов НИПТ. Они отличаются объёмом исследования, показаниями и ограничениями. Важно чтобы понять, какой тест подходит именно Вам.

В каких случаях выполнение НИПТ невозможно?

Итак, выполнение неинвазивных пренатальных тестов возможно при одноплодной и двуплодной беременности. Если беременность одноплодная естественная или наступила после ЭКО с использованием собственной яйцеклетки, то доступны все исследования НИПТ. В остальных случаях существуют ограничения.

В чем отличия разных тестов линейки НИПТ?

НИПС Т21 (Геномед)- диагностика только синдрома Дауна. В исследовании выявляется дополнительная 21 хромосома, если она есть у плода. Синдром Дауна считается одной из самых частых хромосомных аномалий и его частота растёт с увеличением возраста женщины. Выполняется при беременности вследствие естественного зачатия, при ЭКО с собственной яйцеклеткой или при использовании донорской яйцеклетки; при беременности одним плодом и двойней, а также при суррогатном материнстве и если произошла редукция одного эмбриона в двойне.

НИПС 5 – ДНК тест на 5 синдромов (Геномед) – неинвазивный тест на 5 синдромов, можно определить аномалии 13, 18, 21 и в большинстве исследований выявить аномалии половых хромосом X и Y.

НИПС 5 универсальный, его выполнение возможно как при одноплодной естественной беременности, так и при беременности двойней, при носительстве донорской яйцеклетки, суррогатным матерям и в том случае, когда один плод в двойне редуцирован.

3 тестовые базовые панели:

Базовые панели позволяют выявить хромосомные аномалии 13,18, 21, Х и Y хромосом плода, а также триплоидии.

НИПС (Геномед) – включает определение вышеперечисленных синдромов (скрининг 13, 18, 21, Х, Y хромосом плода) и определение носительства у матери частых мутаций, которые могут привести к наследственным болезням, если ребенок унаследует два дефектных рецессивных гена от обоих родителей или один доминантный ген. Данные мутации выявляются в крови без выделения ДНК плода, т.е. оценивается не хромосомная мутация плода, а наличие аномальных вариантов генов у матери.

Генетические заболевания, связанные в тестируемыми в этом исследовании вариантами генов:

НИПС уникален не только клинической значимостью, но и доступностью. Одноплодная беременность, беременность двойней (с определением зиготности), в том числе при редукции одного из эмбрионов в двойне. При ЭКО с донорской яйцеклеткой и суррогатном материнстве этот тест нецелесообразен, так как определять мутации, связанные с генетическими заболеваниями нужно по крови той женщины, чья яйцеклетка дала начало эмбриону.

Следующие 2 панели включают микроделеционные синдромы:

Микроделеции – это поломки сегмента хромосом, которые являются менее распространенными, но не менее опасными, и их невозможно заподозрить на УЗИ.

НИПТ Panorama, расширенная панель (Natera) – исследуются и стандартные аномалии хромосом (13,18,21, Х, Y, триплоидии) и микроделеционные синдромы. Если у Вас беременность одноплодная естественная или в результате ЭКО с собственной яйцеклеткой, то выполнение данных панелей возможно.

При наличии двух плодов, ЭКО с донорской яйцеклеткой и суррогатном материнстве определить сегментарные нарушения технически невозможно.

Можно ли определить пол плода и в каких случаях?

Да, по желанию женщины любой НИПТ определяет пол плода и это доступно как при одноплодной, так и при двуплодной беременности.

Обращаем Ваше внимание, что получение результатов, указывающих на риски развития патологических синдромов, требует консультации генетика и дополнительной инвазивной диагностики.

Источник

Фракция фетальной днк что это такое

Поступление вфДНК в кровоток тесно связано с морфогенезом плаценты. В связи с этим, изменение состояния плаценты напрямую отражается на уровне циркулирующей вфДНК. Стоит отметить, что размер плаценты не влияет на уровень фетального генетического материала в крови матери.

Патологии беременности, при которых наблюдается увеличение уровня вфДНК в крови беременной:

— риск преждевременных родов;

— задержка внутриутробного развития плода (особенно, вследствие фетоплацентарной недостаточности).

При преэклампсии первый рост уровня вфДНК наблюдается между 17 и 28 неделями гестации, второй раз уровень вфДНК возрастает примерно за 3 недели до развития клинической преэклампсии.

Для анализа уровня вфДНК в образце крови беременной, чаще всего, применяют количественной ПЦР.

вфДНК представляет собой ценный материал также для диагностики генетических аномалий плода:

Распространенные аутосомные анеуплоидии

Анеуплоидии половых хромосом

Редкие аутосомные анеуплоидии

Полнохромосомная анеуплоидия любой из аутосом (трисомии 7, 15, 16 или 22 хромосом встречаются чаще всего)

Микроделеции и микродупликации

Синдром Вольфа-Хиршхорна (терминальная 4p делеция)

Синдром кошачьего крика (терминальная 5p делеция)

Синдром Лангера-Гидиона (8q24 делеция)

Синдром Якобсена (терминальная 11q делеция)

Синдромы Прадера-Вилли и Ангельмана (15q11.2-q13 делеция)

Синдром Ди Джорджи (22q11.2 делеция)

Варианты числа копий фрагментов, размером более 7 Мб

вфДНК может быть использована также для определения пола плода.

Для диагностики большинства перечисленных генетических аномалий плода коммерчески и клинически доступен неинвазивный пренатальный тест (НИПТ). Для проведения НИПТ и получения надёжных достоверных результатов необходимо определение фетальной фракции (фф), отношения уровня вфДНК к уровню общей внеклеточной ДНК в крови беременной.

Источник