Хемилюминесцентный иммуноанализ что это значит
Современные возможности технологии хемилюминесцентного анализа в хирургической клинике
Ю.С. Винник, А.А. Савченко, О.В. Теплякова, Е.В. Онзуль, А.И. Дробушевская
ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития РФ им. В.Ф.Войно-Ясенецкого»,
Кафедра общей хирургии
История изучения хемилюминесценции (ХЛ) биологических объектов насчитывает около пяти десятилетий с тех пор, как итальянские астрономы Л.Колли и У.Фаччини обнаружили свечение непигментированных тканей растений. Если в первых работах интерес к ХЛ был связан, в основном, с поисками принципиальных доказательств образования возбужденных и свободнорадикальных состояний в темновых биологических реакциях, то сейчас ХЛ является по существу обычным лабораторным методом, широко используемым в клинике. Успехи в этой области во многом связаны с совершенствованием техники регистрации слабых световых потоков, позволяющей улавливать излучение отдельных клеток и получать микроскопическое изображение свечения [11, 17].
На сегодняшний день химические и физические явления, лежащие в основе превращения энергии биохимических реакций в световое излучение, в основном расшифрованы. Хемилюминесцентная реакция включает следующие основные стадии: а) восстановление одного из участников реакции и окисление второго, приводящее к накоплению химической энергии в системе; б) перенос электрона на один из более высоких энергетических уровней и образование, таким образом, продукта реакции в электронно-возбужденном состоянии; в) высвечивание фотона при переходе молекулы из электронно-возбужденного в основное состояние (люминесценция) [2, 3, 19]. Разнообразие реальных механизмов хемилюминесцентных реакций определяется природой и энергетикой отдельных стадий, структурой реагентов, большим числом промежуточных и конечных продуктов.
Сверхслабое свечение или собственное излучение клеток и тканей практически всегда сопровождает процессы жизнедеятельности и может быть обусловлено тремя типами реакций: реакциями активных форм кислорода (АФК), реакциями цепного (перекисного) окисления липидов, реакциями с участием оксида азота [22]. Главным источником АФК в организме человека и животных служат клетки-фагоциты: гранулоциты, моноциты крови и тканевые макрофаги. Непосредственной причиной собственной хемилюминесценции активированных фагоцитов считают образование синглетного кислорода в реакциях между кислородными радикалами, перекисью водорода и гипохлоритом.
Одной из основных составляющих собственной (неактивированной) хемилюминесценции животных клеток и тканей является свечение, сопровождающее цепное окисление липидов в мембранных структурах клеток и липопротеинах крови. В реакции взаимодействия двух радикалов липопероксида образуются молекулы кетона и кислорода в электронно-возбужденном состоянии, которые затем переходят в основное состояние, испуская квант света (фотон). Увеличение продукции радикалов в системе сопровождается ростом интенсивности ХЛ. Вещества-антиоксиданты, реагирующие со свободными радикалами и тормозящие цепное окисление, одновременно подавляют хемилюминесценцию. При этом подавление собственной хемилюминесценции тканей и клеток антиоксидантами, например токоферолом, указывает на то, что это свечение обусловлено реакциями цепного окисления липидов. С другой стороны, изучая влияние различных природных и синтетических соединений на кинетику ХЛ, можно получать представление о способности этих веществ препятствовать повреждающему действию свободных радикалов [5, 12, 22].
Собственная хемилюминесценция, сопровождающая биохимические реакции в клетках и тканях, отличается низкой интенсивностью, что явилось основным препятствием на пути к широкому ее использованию в аналитических целях. Значительное распространение получило измерение хемилюминесценции в присутствии активаторов (индукторов). Химическими активаторами (зондами ХЛ) называют соединения, вступающие в реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии. Наблюдаемое при этом свечение связано с переходом молекул в основное состояние, что приводит к высвечиванию фотонов. Известными представителями группы химических активаторов являются люминол (3-аминофталевый гидразид) и люцигенин [Бис(N-метилакридиний)] [2, 5].
Физические активаторы не вступают в химические реакции и не влияют на ход реакций, сопровождающихся свечением, но, тем не менее, многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции. К ним относятся некоторые люминесцирующие соединения, усиливающие ХЛ при цепном окислении липидов, в том числе родамин Ж, ализариновый красный, конго красный, фуксин кислый, метиленовый голубой, акридиновый оранжевый, некоторые порфирины и редкоземельные металлы. Поиск веществ-активаторов, не оказывающих влияния на ход реакций перекисного окисления, но многократно увеличивающих интенсивность свечения, продолжается в настоящее время.
В широкой клинической практике хемилюминесцентный анализ используется в трех основных вариантах: ХЛ сыворотки крови и других биологических жидкостей, клеточная ХЛ и хемилюминесцентный иммунный анализ.
Индуцированная ХЛ сыворотки крови, по мнению большинства исследователей, является наиболее чувствительным и объективным методом изучения процесса перекисного окисления липидов. Реакции цепного окисления отличаются большой сложностью и включают в себя целый ряд быстропротекающих стадий. Основные участники реакций, свободные радикалы, обычными методами химического анализа определены быть не могут из-за своей крайне высокой реакционной способности и неустойчивости в биохимических системах. Поэтому регистрация интенсивности свечения в режиме реального времени представляет собой ценную информацию для анализа механизма реакций перекисного окисления липидов.
Уровень ХЛ сыворотки крови является отражением подвижного равновесия, объективным интегральным показателем соотношения интенсивности ПОЛ и активности биологических антиоксидантных систем организма. Регистрация ХЛ тканей и биологических жидкостей лежит в основе многообразия методов выявления ранних стадий нарушения защитно-приспособительных реакций организма, диагностики состояния предболезни, определения прогноза и тяжести заболевания, выбора этиопатогенетического воздействия и контроля состояния пациента [1, 11, 15, 18].
Концентрация свободных радикалов в исследуемом объекте определяется по значению максимальной интенсивности сигнала (I max) и светосуммы (S). Антиоксидантный потенциал пробы коррелирует со скоростью падения кривой хемилюминесценции (tg a) и коэффициентом К, определяемым по соотношению I max/S. При острых воспалительных процессах наблюдается увеличение I max и S, при этом степень увеличения пропорциональна тяжести воспалительного процесса. Снижение значений указанных показателей более чем в два раза регистрируется при наличии злокачественных новообразований [5, 13].
Анализ кинетики хемилюминесцентных реакций различных биологических жидкостей (сыворотки крови, мочи, ликвора, слюны, раневого, плеврального и перитонеального экссудата) позволяет осуществлять дифференциальную диагностику неспецифического воспаления и онкологического процесса, функционального и органического поражения. Так, определение интенсивности ХЛ сыворотки крови лежит в основе экспресс-метода дифференциальной диагностики приступа абдоминальной формы периодической болезни и заболеваний, протекающих с картиной «острого живота», и позволяет уменьшить частоту необоснованных хирургических вмешательств [2, 11, 18].
Существенный интерес представляет изучение влияния на ХЛ разнообразных внешних агентов, обладающих как про-, так и антиоксидантным действием. В клинической практике способность антиоксидантов подавлять люцигенинзависимую хемилюминесценцию используется для оценки их количественного содержания в биологическом материале. С другой стороны, анализ интенсивности ХЛ является адекватным критерием эффективности и безопасности антиоксидантной и окислительной терапии [8, 9, 10, 16, 20]. Исследование ХЛ сыворотки крови позволило подтвердить, в частности, эффективность озонотерапии в компенсации свободнорадикального окисления [8, 9, 16, 17].
По мнению Е.В.Иванишкиной и соавт., наиболее информативным хемилюминесцентным показателем контроля эффективности микроволновой резонансной терапии в лечении язвенной болезни является суммарная антиоксидантная активность сыворотки крови. Изучение динамики ХЛ раневого экссудата у больных с длительно незаживающими ранами и трофическими язвами нижних конечностей позволяет прогнозировать скорость процесса репарации и оценить эффективность влияния различных средств местного лечения.
В последнее время, однако, термин «клеточная ХЛ» чаще употребляется в более узком смысле: так называют свечение, сопровождающее продукцию активных форм кислорода клетками-фагоцитами. В основе этого типа клеточной ХЛ лежит образование супероксидного анион-радикала в результате одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода ферментной системой НАДФН-оксидазой. Дальнейшие превращения этого первичного радикала сопровождаются хемилюминесценцией. Высокая чувствительность данного метода, абсолютная безвредность по сравнению с радиоиммунологическим анализом, а также большой научный интерес к деятельности клеток-фагоцитов привели к тому, что число публикаций по данному вопросу ежегодно исчисляется тысячами, а сфера применения метода постоянно растет. ХЛ анализ позволяет исследовать механизмы активации фагоцитов (полиморфноядерных лейкоцитов, тканевых макрофагов), оценить иммунореактивность организма под влиянием иммунодепрессивных и стимулирующих воздействий, выявить недостаточность опсонических факторов сыворотки, в том числе индуцирующихся при активации альтернативного пути комплемента, специфических антител.
Метод регистрации ХЛ клеток крови позволяет проводить изучение и отбор иммуномодулирующих фармакологических препаратов на основании сравнения люминолзависимой стимулированной хемилюминесценции до и после введения в пробу с лейкоцитарной взвесью исследуемых препаратов.
Хемилюминесцентный тест является высокочувствительным и безопасным методом диагностики непереносимости лекарственных средств. В случае непереносимости инкубация цельной крови с раствором этих препаратов в терапевтических концентрациях сопровождается достоверным снижением генерации активных форм кислорода нейтрофилами, стимулированными неспецифическими активаторами. Снижение люминолзависимой хемилюминесценции цельной крови при непереносимости лекарственного препарата отмечается независимо от химических свойств и принадлежности медикаментов к фармакологическим группам.
Возможности хемилюминометрии значительно расширились после разработки ее модификаций, основанных на хемилюминесцентном иммунном анализе. Для определения содержания в средах организма антигенов, антител и биологически активных веществ используется связывание одного из реагентов с хемилюминесцентной меткой, изменяющей энергетическое состояние во время иммунологической реакции антиген-антитело. Хемилюминесцентной меткой чаще всего служат низкомолекулярные соединения, по химической структуре близкие люминолу и люцигенину, такие как изолюминол, сукцинилированный люминол, эфиры акридиния и другие. Присоединение метки производится либо к антигену, т.е. низкомолекулярному соединению (хемилюминесцентный иммунный анализ), либо к антителу на этот антиген (иммунохемилюминометрический анализ). Оба метода направлены на экспресс-определение биологически активных низкомолекулярных соединений (гормонов, антител, лимфокинов и др.) в сверхнизких концентрациях [7, 24].
В заключении необходимо отметить, что анализ данных литературы демонстрирует большие возможности применения хемилюминесцентного анализа в клинико-биохимических лабораториях для целей медицинской диагностики. К перспективам использования метода можно отнести расширение круга изучаемых заболеваний, уточнение патогенеза болезней и прогнозирование их исхода, динамическое наблюдение за эффективностью терапии, определение новых направлений лечебно-профилактического воздействия.
1. Авзалетдинова, А.Р. Хемилюминесценция крови и мочи у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом /А.Р. Авзалетдинова, Р.Р. Фархутдинов, Р.М. Фазлыева // Здравоохранение Башкортостана.- 1994.- №4.- С. 36- 39.
3. Дамбаева, С.В. Оценка продукции активных форм кислорода методом лазерной проточной цитометрии в клетках периферической крови человека / С.В. Дамбаева, Д.В. Мазуров, Б.Г. Пинегин // Иммунология.- 2001.- №6.- С.58- 60.
4. Демин, Д.Б. Прогностическое значение содержания продуктов липопероксидации в тканях при панкреонекрозе / Д.Б. Демин, В.С. Тарасенко, Д.В. Волков // Вестник хирургии.- 2003.- Том 162.- №5.-С. 47-50.
6. Друх, В.М. Метод изучения хемилюминесценции лейкоцитов цельной крови / В.М. Друх // Клин. лаб. диагностика.- 2004.- №12.- С.41.
7. Кондрашова, Е.А. Хемилюминесценция как наиболее чувствительный метод иммуноферментного анализа и его применение / Е.А. Кондрашова, М.Г. Кожанов// Клиническая лабораторная диагностика.- 1999.- №9.- С.32.
9. Коррекция гомеостаза при остром панкреатите методом озонотерапии / М.И. Гульман, Ю.С. Винник, С.В. Миллер и др.//- Красноярск, 2003.-С.179.
10. Кузнецов, Н.А. Результаты применения синтетических антиоксидантов в лечении больных деструктивным панкреатитом / Н.А. Кузнецов, Г.В. Родоман // Хирургия.-2005.-№3.- С.36-39.
12. Меньшикова, Е.Б. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи современной биологии.- 1993.- №4.- С. 422- 455.
13. Меньшикова, Е.Б. Окислительный стресс при воспалении / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи современной биологии.- 1997.- №2.- С. 155- 171.
15. Островский, В.К. Оценка тяжести и прогноз гнойно-деструктивных заболеваний органов брюшной полости / В.К. Островский, А.В. Мащенко // Хирургия.- 2007.- №1.- С.33.37.
17. Стежко, Д.В. Новая хемилюминесцентная технология и прибор определения воздействия озона во время проведения сеансов озонотерапии / Д.В. Стежко // Новая технология: Научн. техн. сборник.- 2003.- №1.- С. 21-24.
18. Терехина, Н.А. Хемилюминесцентный анализ биологических жидкостей больных сахарным диабетом / Н.А. Терехина // Клин. лаб. диагностика.- 2004.- №10.- С.20.
Хемилюминесцентный иммуноанализ что это значит
В настоящее время представлено множество моделей автоматических анализаторов, отличающихся по методу, используемому для обнаружения искомого вещества. Основными используемыми методами анализа являются:
Рассмотрим подробней иммунохемилюминесцентный анализ.
Иммунохемилюминесцентный анализ основывается на иммуноферментном методе, принцип которого был разработан в 1971, как замена радиоиммунному анализу, который представлял опасность для здоровья сотрудников лаборатории, проводивших исследования.
Дальнейшее развитие систем анализа использующих ИФА, в том числе их повсеместная автоматизация, привели к появлению разновидностей ИФА, а именно иммунохемилюминесцентному анализу.
Иммунохемилюминесцентный анализ (ИХЛА) является лабораторным анализом, который сочетает хемилюминесценцию (электромагнитное излучение, вызванное химической реакцией с образованием света) с реакцией образования иммунного комплекса «антиген-антитело». Как и в случае с другими видами иммуноанализа (РИА, ИФА), в ИХЛА используются химические компоненты, которые могут генерировать световое излучение в результате химической реакции, например, меченные антитела. Таким образом, метод обладает высокой чувствительностью и позволяет обнаружить широкий спектр веществ белковой природы.
ИХЛА бывает двух типов качественный и количественный. В первом случае определяется наличие или отсутствие в анализируемом материале искомого компонента, во втором случает определяется найденная концентрация определяемого компонента в материале. Чаще всего используется количественный тип ИХЛА.
В лабораторной диагностике, с применением ИХЛА, основными видами исследуемых жидкостей организма являются цельная кровь, плазма, сыворотка, моча, спинномозговая жидкость, мазки с слизистых оболочек. Вид используемой в исследовании жидкости определяется используемой моделью анализатора и совместимыми наборами реагентов.
Основные плюсы метода:
— Безопасность для персонала, проводящего исследование;
— Широкий спектр применения;
— Относительная простота используемого оборудования;
— Широкий линейный диапазон.
Основные минусы:
— Дороговизна реагентов и оборудования;
— Интерпретацию результатов должен осуществлять специалист;
— Низкая восприимчивость к инфекционным заболеваниям (большинство используемых реагентов могут лишь косвенно указать на наличие инфекции)
— Лечащему персоналу необходимо знать, какой аналит должен быть найден, при назначении исследования.
В последние годы ИХЛА привлекает все большее внимание в различных областях, включая биологию, клиническую диагностику, мониторинг окружающей среды, безопасность пищевых продуктов и фармацевтический анализ.