Фосфатаза или пероксидаза что это

Прежде чем оценить эффективность тепловой обработки мо­лока, определяют его термоустойчивость по пробе на кипячение, хлоркальциевой, тепловой и алкогольной пробам в соответствии с Инструкцией по техническому контролю на предприятиях мо­лочной промышленности.

Проба на кипячение заключается в следующем. В химический стакан или колбу наливают 10—20 см3 молока (сливок), нагрева­ют на электроплите до кипячения и определяют консистенцию. Выпадение хлопьев белка указывает на пониженную стойкость молока (сливок) к нагреванию. Для лучшего и точного контроля молоко рекомендуется вылить в чашку Петри.

Для проведения хлоркальциевой пробы в сухую пробирку отме­ривают 10 см3 молока (сливок) и из бюретки добавляют 0,5 см3 1%-ного раствора СаС12, все перемешивают и помещают пробир­ку в кипящую водяную баню на 300 с. Затем пробирку вынимают, охлаждают и визуально наблюдают образование хлопьев белка. Наличие хлопьев белка от едва заметных до явно различимых указывает на пониженную стойкость к нагреванию или ее отсут­ствие.

Тепловая проба распространяется на молоко, сливки и норма­лизованные смеси. Она основана на выдерживании исследуемо­го образца продукта при температуре 20 «С, давлении около 0,2 МПа в течение 30 мин. После такой тепловой обработки визу­ально определяют консистенцию молока. При наличии мелких или крупных хлопьев молоко, сливки, смеси молочные считают нетермостойкими.

Алкогольная проба основана на воздействии этилового спирта на белки молока и сливок, которые полностью или частично де­натурируют при смешивании равных объемов молока или сливок со спиртом. Данным методом исследуют сырое и подвергнутые тепловой обработке молоко и сливки с массовой долей жира не более 40%. Определение термоустойчивости по алкогольной пробе осуществляется в соответствии с ГОСТ 25228. При прове­дении этой пробы в сухую чашку Петри наливают 2 см3 исследу­емого продукта и приливают 2 см3 этилового спирта требуемой объемной доли. Молочно-спиртовую смесь перемешивают кру­говыми движениями и через 120 с наблюдают изменение консис­тенции анализируемого продукта. Если не произошло коагуля­ции белков молока и при стекании молочно-спиртовой смеси дно чашки остается чистым — молоко выдержало алкогольную пробу. Такое молоко считают пригодным для стерилизации. Для получения более четких результатов чашки Петри помещают на черный фон. Молоко и сливки подразделяют на группы в зависи­мости от того, какой раствор спирта не вызвал осаждения хлопь­ев: I — этиловый спирт с 80%-ной объемной долей соответствует, II-с 75%-ной, III-с 72%-ной, IV-с 70%-ной и V —с 68%- ной объемной долей.

Эффективность пастеризации молока и молочных продуктов контролируют химическим методом по ГОСТ 3623 «Молоко и молочные продукты. Методы определения пастеризации», мик­робиологическим методом в соответствии с Инструкцией по тех­ническому контролю на предприятиях молочной промышленно­сти.

Химические методы основаны на определении присутствия пероксидазы и фосфатазы в сыром молоке и приготовленных из него продуктах и отсутствия этих ферментов в пастеризованном молоке и продуктах, выработанных из него. Сущность химичес­ких методов заключается в разложении (пероксидазой) или гид­ролизе (фосфатазой) внесенных в молоко химических реактивов и изменении при этом его цвета. Температура инактивации (раз­рушения) ферментов выше температуры, при которой погибают патогенные микроорганизмы. Если в молоке отсутствуют эти ферменты, то отсутствуют и патогенные бактерии, а молоко счи­тают пастеризованным при заданном режиме и безопасным в са­нитарно-гигиеническом отношении.

Пероксидаза инактивируется при температуре не ниже 80 «С и выдержке 20—30 с. При отсутствии фермента в молоке и молоч­ных продуктах цвет исследуемого образца не меняется. Следова­тельно, молоко и молочные продукты пастеризовали при темпе­ратуре не ниже 80 °С. При наличии пероксидазы исследуемый образец окрашивается в темно-синий цвет. Это указывает на то, что молоко и молочные продукты не пастеризовали или пастери­зовали при температуре ниже 80 °С либо они были смешаны с непастеризованными продуктами. Чувствительность метода по ГОСТ 3632 позволяет обнаружить добавление не менее 5 % непа­стеризованных молочных продуктов к пастеризованным, а для напитков с плодово-ягодными наполнителями — 0,5 %.

Термоустойчивость фосфатазы меньше, чем пероксидазы. Фосфатаза инактивируется при температуре не ниже 63 °С при выдержке 30 мин. Если фермент отсутствует в молоке и молоч­ных продуктах, цвет исследуемого образца не изменяется, т. е. аналогичен цвету контрольного образца. Поэтому считают, что молоко и молочные продукты были пастеризованы при темпе­ратуре не ниже 63 °С. При наличии фосфатазы в молоке и мо­лочных продуктах исследуемый образец имеет окрашивание от светло-розового до темно-красного. Следовательно, молоко и молочные продукты пастеризовали при температуре ниже 63 «С или они были смешаны с непастеризованными молочными продуктами. Творог на пастеризацию исходного сырья — моло­ка и сливок определяют по фосфатазе не позднее 7 сут с момен­та выработки, сметаны — не позднее 5 сут. Чувствительность метода по ГОСТ 3623 позволяет обнаружить добавление непас­теризованных молочных продуктов к пастеризованным: 0,3 % в молоке, сливках, кисломолочных напитках, 0,5 % в твороге и сметане и 1 % в напитках с плодово-ягодными наполнителями и сыворотке.

Определять эффективность пастеризации химическим мето­дом (ферментные пробы) необходимо из каждой наполненной пастеризованным молоком емкости. На переработку или розлив молоко можно направлять только после получения отрицатель­ной реакции на фосфатазу.

Микробиологическим методом эффективность пастеризации контролируют на каждом пастеризаторе не реже 1 раза в 10 дней вне зависимости от качества готовой продукции. Пастеризацию считают эффективной при отсутствии бактерий группы кишеч­ных палочек в 10 см3 молока и общем количестве бактерий до 10000 в 1 см3 молока.

Эффективность пастеризации молока для заквасок проверяют следующим образом. Пробу пастеризованного молока в количе­стве 10—20 см3 отбирают асептически и помещают в стерилизо­ванную посуду, выдерживают в течение 24—48 ч при 40—45 °С, отмечают характер полученного сгустка в пробирке и просматри­вают его под микроскопом. Если пастеризация была проведена

при температуре до 90 ± 1 °С, сгусток получается плотным, и под микроскопом обнаруживают большое число стрептококков. Если пастеризация проведена при 92—95 °С, но при недостаточной выдержке или без эффективного перемешивания, сгусток может быть слабым, микроскопированием выявляют в препаратах зер­нистые и незернистые палочки. При установлении в молоке пеп- тонизации (наличие зоны просветления в верхнем слое) можно сделать заключение о правильно проведенной пастеризации (температура 92—95 °С с выдержкой 20—30 мин). Эффективность пастеризации молока для закваски проверяют в том случае, если в стрептококковых заквасках микроскопированием или посевом обнаружены палочки.

Для контроля пастеризованного молока или сливок на наличие термоустойчивых молочнокислых палочек готовят разведение в стерильном растворе хлорида натрия исследуемого образца про­дукта. В соответствии с Инструкцией по микробиологическому контролю производства на предприятиях молочной промышлен­ности полученные разведения засевают в стерильное обезжирен­ное молоко (до 6-го разведения), помещают посевы в термостат температурой 40—44 °С и выдерживают 3 сут. Полученные сгустки микроскопируют и устанавливают наличие или отсутствие в них молочнокислых палочек. Стойкость пастеризованного молока за­висит от наличия остаточной микрофлоры после тепловой обра­ботки, чистоты технологического оборудования, молокопроводов, тары, условий хранения, транспортирования и реализации.

Для прогнозирования стойкости пастеризованного молока при внутрицеховом или внутризаводском контроле можно ис­пользовать следующий метод. В пробирки наливают по 1 см3 ра­бочего раствора резазурина и по 10 см3 пастеризованного молока, отобранного из бутылок, пакетов после разливочно-упаковочно — го агрегата, закрывают резиновыми пробками и смешивают. За­тем эти пробирки помещают в редуктазник или водяную баню. Температуру воды в редуктазнике или водяной бане поддержива­ют постоянной (38—40 °С) в течение 1 ч. После этого снимают показания (цвет) с продукта в пробирках. Оценку результатов проводят согласно шкале прогноза стойкости пастеризованного молока, представленной в Инструкции по микробиологическому контролю производства на предприятиях молочной промышлен­ности.

Эффективность тепловой обработки на линии стерилизации мо­лока контролируют не реже 2 раз в неделю методом определения промышленной стерильности. Этот метод основан на способно­сти микроорганизмов, выдержавших стерилизацию, размножать­ся в стерилизованном молоке при оптимальных режимах термо- статирования и вызывать в нем органолептические и физико-хи­мические изменения.

Для проведения анализа отбирают упаковки со стерилизован­ным продуктом и выдерживают молоко при температуре 36— 38 «С в течение 3 сут и 5 сут — сливки. Молоко, выработанное двухступенчатым методом, термостатируют при 55 ± 1 °С в тече­ние 5 сут, после чего образцы подвергают внешнему осмотру. Если упаковка вздулась или изменился внешний вид молока в бутылках (наличие сгустка, отстой сыворотки, хлопьев молока и др.), продукт считают не отвечающим требованиям промышлен­ной стерильности, если не установлено изменений его консис­тенции и вкуса. Упаковки, не имеющие внешних дефектов, не вскрывают. Молоко и сливки проверяют органолептически. Для установления причины порчи или в других случаях в стерилизо­ванном молоке определяют кислотность и проводят микробиоло­гические исследования — микроскопируют и высевают 1 см3 тер­мостатированного образца для определения общего количества бактерий.

Продукт отвечает требованиям промышленной стерильности, если кислотность молока увеличилась не более чем на 2 °Т, в микроскопическом препарате отсутствуют клетки бактерий, а об­щее их количество в 1 см3 не превышает 1

Источник

Фосфатаза или пероксидаза что это

Пероксидаза (ПО; КФ 1.11.1.7) относится к классу оксидоредуктаз. Основная функция ПО – катализировать окисление химических соединений за счет пероксидного кислорода с образованием промежуточных комплексов [1].

Пероксидазы подразделяются на два семейства – животные и растительные [2]. Семейство растительных пероксидаз состоит из трех классов, выделяемых на основании исследований аминокислотных последовательностей ферментов [3]. К первому классу растительных ПО относятся внутриклеточные ферменты: аскорбатпероксидаза, бактериальная каталаза-пероксидаза и дрожжевая цитохром-с-пероксидаза, второй класс включает секретируемые грибные ферменты, а к третьему классу относятся секретируемые пероксидазы растений [4].

Пероксидаза является одним из ферментов, участвующих в регуляции роста и развития растительных организмов, поскольку катализирует защитные реакции от повреждений различного типа, а также участвует в формировании клеточной стенки и дыхании растений [5–7]. Доказана ее роль в образовании ауксина, этилена, восстановлении нитратов и нитритов, то есть в азотном обмене, ростовых процессах [8]. В присутствии ПО регулируется созревание и старение тканей, синтез лигнина [8]. ПО – наиболее часто изучаемый фермент при анализе сомаклональной изменчивости, возникающей в культуре ткани в условиях in vitro [9]. Кроме того, энзим является чувствительным к разного рода неблагоприятным воздействиям и широко используется исследователями для оценки чувствительности/устойчивости к стрессу [10–12]. ПО является индуцибельным ферментом, индуктором которого могут служить физические, химические и биологические факторы. Кислые и основные пероксидазы участвуют в ответных реакциях при стрессовом состоянии растительного организма. В самом начале активируются основные ПО, а изменения, связанные с метаболизмом ауксина и этилена, индуцируют усиление синтеза кислых ПО как более поздний шаг ответа или защиты.

Пероксидазную активность определяют не только для анализа метаболизма растений, но и в клинико-биохимических исследованиях патологических процессов животных тканей, для диагностики хронических и острых, а также аллергических заболеваний. Кроме того, лиофилизированные препараты ПО используются для диагностики бактериальных, аллергических, аутоиммунных и онкологических заболеваний, включая СПИД и лепру [13–18].

В настоящее время существует множество методов определения активности и выявления изоферментного спектра пероксидаз; некоторые методики весьма трудоемки, малочувствительны, дают противоречивые результаты [19–22]. Разнообразие методик определяется широкой субстратной специфичностью пероксидазы, поскольку фермент проявляет активность в присутствии пероксида водорода по отношению ко многим фенолам и ароматическим аминам: двухатомному фенолу пирокатехину (о-диоксибензолу), монометиловому эфиру пирокатехина – гваяколу, оксипроизводному нафталина – 1-нафтолу, 4,4′-диаминодифенилу, известному как бензидин, а также производному бензидина – 3,3′-диметоксибензидину (о-дианизидину), 2,2-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой) кислоте (АБТС) и многим другим [1, 21]. Таким образом, фермент является строго специфичным по отношению к перексиду водорода и широко специфичным – к другим субстратам [1]. Активность изоформ фермента также зависит от природы субстратов, а физиологические функции отдельных форм значительно отличаются. Отмечена видовая, органная, тканевая, внутриклеточная специфичность ПО [1].

В связи со значительным многообразием методов определения активности и выявления изоферментного спектра пероксидазы с применением различных субстратов целью настоящей работы явился обзор собственных 15-летних исследований, а также работ других авторов для выявления наиболее быстрого, незатратного, чувствительного способа в оптимальных субстратных условиях.

Объекты исследования

Обсуждаемые в обзоре эксперименты по определению активности и изоферментного спектра пероксидазы выполнены с использованием культурального фильтрата корневой губки различных штаммов (Heterobasidion annosum (Fr.) Bref.), почек дуба черешчатого (Quercus robur L.), листьев вяза обыкновенного (Ulmus laevis L.), микроклонов карельской березы (Betula pendula Roth var carelica Merkl.) и березы повислой (Betula pendula Roth), а также вейгелы цветущей «вариегата» (Weigela florida «Variegata» Bunge A.D.C.), хвои сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), трансгенных растений сахарной свеклы (Beta vulgaris L.), сыворотки крови людей, больных артериальной гипертензией.

Получение ферментных препаратов из растительных тканей

Для получения растительных ферментных экстрактов навеску растительного материала растирают с битым песком в экстрагирующем буфере (0,1 М трис-НСl буфер, рН 7,5). Соотношение навески и буфера составляет в зависимости от образца от 1:4 до 1:10 (w/v). Гомогенат центрифугируют в эппендорфах в течение 10 минут при 20000 g, + 4 °С, на центрифуге СМ50 ELMI (Латвия). Надосадочные жидкости сохраняют при –3 °С в твердотельном термостате BIOSAN CH-100 (Латвия).

Буферы для определения активности пероксидазы

Молярность буфера. При изучении влияния молярности буфера на активность фермента установлено, что максимальная активность ПО в реакции с бензидином наблюдалась в 100–200 mM (0,1–0,2 М) трис-НСl буфере при рН 7,0.

Субстраты для определения активности пероксидазы

В проведенных нами экспериментах кинетика насыщения фермента субстратами имела вид равнобочной гиперболы, поэтому константы Михаэлиса определяли по методу двойных обратных величин (координаты Лайнуивера – Берка) [23]. Каталитическую активность устанавливают на основании детекции окрашенных продуктов реакции при 25 °С. Субстратная смесь состояла из 0,05 мл 0,1 % водного раствора АБТС (конечная концентрация 30 мкМ), 2,9 мл буфера, измерение оптической плотности проводят при длине волны 436 нм.

Для определения активности ПО в реакции с бензидином используют метод А.Н. Бояркова, разработанный впервые при использовании ФЭКа в 1951 г. [24]. Бензидиновый реактив включает два компонента [25]. Первый состоит из 50 % спиртового раствора 0,1 % бензидина солянокислого, содержащего 6 % ацетата натрия, 3 % уксусной кислоты. Конечная концентрация бензидина в реакционной смеси – 5,8 mM. Вторым компонентом является 0,5 % раствор пероксида водорода (конечная концентрация 0,3 mM). Значение рН бензидинового реактива составляет менее 2,0 единиц рН, а предварительные исследования выявили рН-оптимум действия ПО, равный 7,0. Поэтому первый компонент бензидинового реактива доводят до нейтрального значения рН растертым в порошок (для неизменности объема смеси) кристаллическим NaОН. Приготовленная таким образом основа бензидинового реактива может храниться в холодильнике при 0–4 °С в течение года. Для упрощения процедуры измерения активности ПО в кварцевую кювету вносят 3 мл первого компонента бензидинового реактива, предварительно согретого до комнатной температуры, и добавляют 18 мкл Н2О2. Измерения проводят при 520 нм.

Выявление изоферментного спектра пероксидаз

Изоферментный спектр ПО выявляют с использованием бензидинового реактива, о-дианизидина, α-нафтола.

Состав и методика применения бензидинового реактива описаны выше.

Х.С. Рафиковым впервые был использован для выявления пероксидазной реакции гаптоглобина крови о-дианизидин [26]. В состав проявляющей смеси входят 50 мл воды, 1 г о-дианизидина, 2,5 мл СН3СООН, 0,2 мл Н2О2. После появления оранжевых полос реакцию останавливают добавлением раствора 15 % уксусной кислоты.

Для приготовления проявляющей смеси с α-нафтолом берут 1 mM 1-нафтола в 0,1 М фосфатном буфере в присутствии 0,33 mM перекиси водорода. Данный метод используется, в частности, в клинико-диагностических лабораториях при цитохимическом диагностировании лейкозов [27].

Вертикальный электрофорез (ЭФ) проводят по стандартному методу Дэвиса в пластинах полиакриламидного геля (7,5 % по акриламидной смеси) при 4 °С. К 0,05–0,2 мл ферментного образца добавляют в качестве антиконвекционной смеси глицерин до конечной концентрации 20 %, в карман геля вносят 20 мкл пробы, в качестве лидирующего красителя используют бромфеноловый синий.

Выявление зон активности проводят по Левитесу [28], Божко [29], Рафикову [30], Юренковой [31, 32]. Гели высушивают на стеклянных пластинах, в целлофане (Балаково), в растворе спирт: глицерин (1:1), а затем сканируют с разрешением 300dpi на сканере HP Scanjet 3770 в окне для прозрачных материалов. Гели хранят в темноте.

Экстракция пероксидаз из различных тканей

Растительные пероксидазы высокостабильны, поэтому в состав экстрагирующего буфера входит только трис-НСl, рН 7.0. Добавление ЭДТА, меркаптоэтанола, хлорида калия, а также поливинилпирролидона не влияет на изменение активности фермента (рис. 1).

Рис. 1. Зависимость активности пероксидазы (А) от состава экстрагирующего буфера в хвое сосны обыкновенной и (Б) длительности экстракции ПО в листьях вяза обыкновенного (гладкого) Ulmus laevis L. Обозначения: А: контроль – экстракция в 0,1 М трис-НС1 буфере, рН 7,0; 1 вар. – контроль + ЭДТА + меркаптоэтанол + КС1; 2 вар – 1 вар. + 5 % поливинилпирролидон

Кроме того, можно отметить нейтральное влияние длительности экстракции фермента (от 30 мин до 12 часов) из сосновой хвои, считающейся труднодоступной для извлечения ферментов, на активность ПО. Полученный после центрифугирования супернатант обнаруживал стабильную активность и неизменность изоформ ПО в течение по крайней мере недели, при этом хранение препарата осуществлялось при 0 °С в присутствии 20 % глицерина.

Наивысшая активность пероксидазы проявляется при молярности трис-НС1 буфера (рН 7,0), составляющей 100 мМ и выше (рис. 3).

Методы определения активности пероксидаз

Принципы методов определения активности ПО основаны на появлении окрашенных продуктов при окислении субстратов под действием пероксидазы, регистрируемых по увеличению оптической плотности при соответствующей длине волны. Одной из важнейших характеристик любого фермента является специфичность его действия по отношению к субстрату. Анализ кинетических характеристик показал, что скорость окисления пирокатехина в КФ корневой губки (Km 29 мM) оказалась на порядок ниже скорости окисления АБТС (Km 40–60 мкМ для разных штаммов), хотя молекула пирокатехина (о-диоксибензол) является фенольным производным и по своему строению проще молекулы АБТС. Скорость окисления бензидина, измеренная в хвое сосны, почках дуба и микроклонах березы и сахарной свеклы, оказывается промежуточной: Km в 0,1 М трис-НС1 буфере при рН 7,0 равна 0,3 mM.

Чувствительность реакции очень высока, поэтому объем используемого ферментативного экстракта мал (1–10 мкл), а время измерения активности фермента составляет не более 3 мин. В случае обнаружения чрезмерно высокой ферментативной активности препаратов их разбавляют 0,1 М трис-НС1 буфером, рН 7,0 для сохранения нормальных кинетических кривых или используют удвоенное количество перекиси водорода (36 мкл). Бензидиновый метод определения активности ПО представляется оптимальным в силу ряда причин: долговременного хранения базового реактива (около года при 0 °С), оптимальных условий рН, доступности компонентов и простоты измерения.

Анализ изоферментного спектра пероксидаз

а) Проявление с использованием бензидина

Для выявления изоформ пероксидазы растительного происхождения применяют бензидиновый реактив при рН 7,0. Перед окрашиванием геля компоненты бензидинового реактива смешивают в соотношении 1:1. После заливки геля бензидиновым реактивом окраска зон пероксидазной активности проявляется в зависимости от количества нанесенного фермента в течение 5–130 минут (рис. 4–6). Иногда гель оставляют в проявляющем растворе на ночь в темноте.

Рис. 3. Влияние молярности трис-НС1 буфера (рН 7,0) на активность пероксидазы из листьев березы повислой in vitro

Выявление изоформ пероксидазы бензидиновым методом позволяет получить достаточно широкий спектр зон фермента.

Этот метод, однако, не подходит для выявления зон гаптоглобина сыворотки крови, т.к. не выявляет всех изоформ фермента [33]. Поэтому для выявления фенотипов гаптоглобина использовали еще два метода.

Рис. 4. Изоферментный спектр ПО в зимних почках (А; февраль) и распускающихся листьях (Б; март, образование на почках зеленого конуса) дуба черешчатого [34]. Плюсовые деревья Шиповой дубравы, Воронеж

По первому из них, предложенному Г.Х. Божко с соавт. [29], проявление геля проводят с использованием бензидинового реактива, исключающего присутствие спирта и уксуснокислого натрия: пластины геля выдерживают в течение 10 мин в 0,1 % бензидине в 10 % уксусной кислоте, после чего гели перемещают в кюветы с 0,03 % раствором перекиси водорода. Окраска ферментативных полос стремительно развивается, но после промывания в воде синяя окраска фермента переходит в коричневую, становится нестабильной, а гели – непригодными для сушки.

Рис. 5. Пероксидазный спектр растений-регенерантов березы различного происхождения в культуре in vitro [35]. Обозначения: 1–4 – карельская береза, узорчатая форма; 2 и 3 – карельская береза, триплоидная узорчатая форма; 4 – карельская береза, безузорчатая форма; 5 – береза повислая; 1 – каллус с регенерирующими побегами; 2 – регенерант; 3 – каллус; 4 – регенерант без корней; 5 – регенерант без корней

Рис. 6. Изоферментный спектр ПО в различных линиях трансгенной сахарной свеклы in vitro [36], выявленный с помощью бензидина. Обозначения: 1 – контроль; 2–10 – опыт

Другим способом выявления спектров гаптоглобина по пероксидазной активности является метод, предложенный Х.С. Рафиковым [30]. Он включает выдерживание гелей в растворе, содержащем 50 мг бензидина, 135 мг гваякола, 25 мл 10 % уксусной кислоты, перед применением раствор разводят водой в соотношении 1:5. К 10 мл бензидин-гваяколового реактива добавляют дополнительно 1 мл 0,2 М ацетата натрия, 0,1 мл 5 мM сульфата марганца и 1 каплю 50 % перекиси водорода. Время проявления составляет 10–20 мин. Реакцию останавливают 15 % уксусной кислотой. Учитывая сложность приготовления проявляющей смеси, в дальнейшем стали применять о-дианизидин, который обычно используют для выявления активности фермента в культуральной жидкости дереворазрушающих и других грибов – представителей белой и коричневой плесеней [33]. Исходя из литературных данных, проявляющая смесь для выявления пероксидазной активности для сыворотки крови состоит из 1 г о-дианизидина, 2,5 мл уксусной кислоты, 0,2 мл перекиси водорода в 50 мл воды. Зоны фермента приобретали красный цвет на фоне темно-вишневого фона геля (рис. 7).

Рис. 7. Электрофореграммы гаптоглобинов сыворотки крови у 20 человек, больных артериальной гипертензией [37]. Обозначения: Типы гаптоглобинов: Нр 1–1–дорожки (слева направо) 1, 3–8, 11, 15–16, 18, 20; Нр 1–2 – дорожки 2, 10, 12–14, 19; Нр 2–2 – дорожки 9, 17

Способ выявления изоформ ПО с помощью о-дианизидина применялся нами и для сравнения спектра фермента из спящих и пробуждающихся почек дуба черешчатого. Результаты приведены на рис. 8.

Рис. 8. Изоферментный спектр ювенильных листьев дуба черешчатого [36]. Обозначения: А – выявление изоформ ПО с помощью о-дианизидина; Б – выявление изоформ ПО с помощью бензидина; Кд – дерево колонновидной формы кроны из Семилукского питомника; К – контрольные деревья; № 6 – № 138 – плюсовые деревья дуба черешчатого позднораспускающейся феноформы

В руководстве Левитаса [28] описан метод выявления изоформ ПО с помощью 0,1 М гваякола (100 мл) в сочетании с 1–3 мл 3 % перекиси водорода. Однако автор указывает, что окраска нестойкая. Этот же автор описывает и бензидиновый способ проявления гелей на ПО-активность при рН 5,0, при этом гель фиксируют в метаноле.

Кроме того, существует способ выявления активности пероксидазной активности в гелях, описанный в статье С.И. Юренковой с соавт. [31] для электрофоретического выявления изоформ цитохром-с-оксидазы. Реакционная смесь для выявления зон фермента включает 1 мл 2 % спиртового раствора 1-нафтола, 25 мл водного раствора диметил-п-фенилендиамина солянокислого (20 мг), 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,4 до 50 мл. Однако при проявлении гелей на цитохром-с-оксидазу выявлялись полосы активности, совпадающие с таковыми при выявлении пероксидазной активности. Такие результаты были получены у почек дуба черешчатого, а также у микроклонально размноженных растений вейгелы цветущей «вариегата», адаптированных к медному и солевому стрессу в ходе длительной ступенчатой адаптации на протяжении 120 суток (рис. 9).

Полученные результаты позволяют нам предположить, что 1-нафтол в данном методе является субстратом для проявления активности ПО, а не цитохром-с-оксидазы.

Рис. 9. Изоферментый спектр пероксидазы в микроклонах вейгелы цветущей «вариегата», адаптированных к солевому и медному стрессам. Обозначения: 1 и 2 – 40 и 120 суток адаптации, субстрат – 1-нафтол в фосфатном буфере; 3 и 4 – 40 и 120 суток адаптации, субстрат – бензидин; к – контроль, с – соль, м – медь. Стрелкой указано направление движения тока при электрофорезе

Изоформы пероксидазы могут быть выявлены разными способами, но при этом надо учитывать, что спектры фермента получаются различными, что связано со скоростью утилизирования субстрата теми или иными формами фермента. Представляется, что метод выявления активности фермента в гелях с помощью бензидина при рН 7,0 является более универсальным. При проявлении изоформ ПО с помощью о-дианизидина появляющиеся зоны менее стабильны, некоторые из них пропадают уже через несколько минут. Через сутки они практически полностью исчезают, тогда как в предыдущем случае, при правильном хранении, гели сохраняют окраску многие годы.

Таким образом, с помощью выявления изоформ ПО можно выявить отличия одного вида растений от другого, стадию регенерации растения, влияние стрессовых воздействий, онтогенетический возраст растения, независимо от того, древесное или травянистое растение берется для анализа.

Гаптоглобин является стрессовым белком крови человека и животных, обладающим пероксидазной активностью [38]. По его количеству можно определить степень тяжести заболевания [39]. Имеют значения и типы гаптоглобина: они связаны с определенным заболеванием. Выявление фенотипов гаптоглобина используется как для выбраковки больных животных, так и для получения потомства от генетически здоровых родителей [40, 41]. При выявлении типов гаптоглобина также используется о-дианизидин.

Заключение

Таким образом, из проанализированных способов определения активности и выявления изоферментного спектра пероксидазы оптимальным представляется метод, основанный на применении бензидинового реактива в нашей модификации, связанной с повышением рН реактива до нейтральных значений (7,0), тогда как в классических методиках рН сильнокислый (2,0). Для электрофоретического выявления изоформ фермента растений бензидиновый способ является наиболее удобным, дешевым, позволяющим получать стабильную окраску гелей.

Источник

• ← Фосфатаза в молоке что это такое
• Фосфатаза кислая что это такое →